A quantidade de frascos Erlenmeyer de 500 mL necessária variará conforme o número de amostras a serem produzidas. Siga o seguinte esquema:

• X amostras em quintuplicatas (x5)
• Cepa Controle de Qualidade Externo ( CCRM0280 ) em quintuplicatas (x5)
• Amostras Branco de Meio de Cultivo (2 frasco Erlenmeyer tratado da mesma forma com meio e nutrientes, mas sem a etapa de inoculação)

Por exemplo: se estivermos comparando 3 espécies diferentes, serão necessários (3*5) + 5 + 2 (=22) frascos no total.

Preenchimento do Arquivo Metadata:

• Código das amostras
• Código das cepas
• Espécie
• Meios de cultivo
• Data de início
• Datas de adição dos nutrientes
• Data de coleta da biomassa
• Método de extração (média polaridade: Diclorometano-Metanol)
• Método de extração 2 (alta-polaridade: Metanol-Água)
• Comentários

Lembre-se de seguir essas etapas para um registro completo e preciso das informações relacionadas ao experimento.

Frascos Erlenmeyer de 500 mL* Frascos tipo Scotch de 250 mL e de 1 litro

• Tubos de centrifuga de 50 mL do tipo Falcon
• Alças estéreis
• Reagentes para preparo das soluções estoque (ver abaixo)
• Centrífuga de Bancada Refrigerada (Hettich Modelo 320R, Tuttlingen, Alemanha)
• SpeedVac (Christ modelo RVC 2-25, Osterode am Harz, Alemanha) no LabMeta - Instituto de Química - UFRJ
• Liofilizador (modelo L120, Liotop, Brazil)

Preparo das Soluções Estoque:

Solução Estoque de NaNO3 : ₃ :

• Utilize um frasco devidamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
• Acrescente 7,5 g de NaNO₃ (NEON, p# 01813) a 100 mL de água destilada
• Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.

Solução Estoque de NaH2PO4•H2O : ₂PO₄•H₂O :

• Utilize um frasco previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
• Adicione 0,5 g de NaH₂PO₄•H₂O (NEON, p# 01415) a 100 mL de água destilada
• Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.

Solução Estoque de Metais-Traço:

• Utilize um frasco lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).

• Adicione os seguintes componentes:

• 23 mg de ZnSO₄•7H₂O

• 152 mg de MnSO₄•H₂O

• 7,3 mg de Na₂MoO₄•2H₂O

• 14 mg de CoSO₄•7H₂O

• 6,8 mg de CuCl₂•2H₂O

• 4,6 g de Fe(NH₄)₂(SO₄)₂•6H₂O

• 4,4 g de Na₂EDTA•2H₂O Complete o volume com água destilada até 1 litro.

• Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.

Solução Estoque de Vitaminas:

• Utilize um frasco que tenha sido previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).

• Adicione os seguintes componentes:

• 200 mg de Tiamina

• 10 mL (0,1 g) de Biotina

• 1 ml (1 g/l) de Cianocobalamina Complete o volume com água destilada até 1 litro.

• Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: Após a autoclavagem do meio o, adicione 1 mL para cada 1 litro de meio. .

Preparo de Solução Estoque de Nutrientes:

• Misture:
• 20 ml da Solução Estoque de NaNO3
• 20 ml da Solução Estoque de NaH2PO4.H2O
• 1 ml da Solução Estoque de Vitaminas
• 1 ml da Solução Estoque de Metais-Traço
• Filtração em filtro em 0.22 um
• Armazene a solução sob resfriamento

Preparo dos Tampões de Algodão:

Materiais necessários: algodão hidrofóbico, gaze, tesoura, barbante.

• Corte um pedaço de gaze do tamanho da palma da mão.
• Abra a gaze e insira parte dela dentro do frasco.
• Coloque o algodão hidrofóbico dentro da gaze que está dentro da boca do frasco.
• Continue inserindo algodão até que, ao retirar a gaze com o algodão do frasco, um som semelhante a "puf" seja ouvido (indicando o vácuo causado pelo Tampão ) .
• Corte um pedaço de barbante.
• Amarre a gaze com o barbante, assegurando que fique bem acima do algodão (sem deixar espaço).
• Corte o excesso de barbante e gaze.
• Verifique se o Tampão está um pouco acima da boca do vidro.
• Se necessário, ajuste sua posição.
• Autoclave : 15 minutos a 15 min a 121^oC.
• Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.

Garanta que cada etapa seja seguida de maneira precisa para assegurar a qualidade do meio de cultivo e dos procedimentos subsequentes.

Os Tampões de algodão são reutilizadas de um cultivo para o próximo. Ao final do cultivo, é suficiente secá-las em uma estufa para evitar a proliferação de fungos.

Preparo do Meio de Cultivo F/2:

• Para 1 litro de água destilada, adicione:

• 41,5 gramas de sal marinho para aquario (Reef Salt)

• 1 mL de Solução Estoque de NaNO3

• 1 mL de Solução Estoque de NaH2PO4•H2O

• 1 mL de Solução Estoque de Metais-Traço

• Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121^oC

• Aguarde o resfriamento.

• Adicione 0,5 mL da Solução Estoque de vitaminas antes de usar.

Separe todos os frascos Erlenmeyer de 500 mL

• Lave-os com Extran a 5%.
• Enxágue-os abundantemente com água destilada.

Importante considerar o número de cepas e réplicas a serem cultivadas.

Prepare os Tampões de algodão para vedar os cultivos

Autoclave os frascos previamente lavados com os Tampões de algodão

• Autoclave : 15 minutos a 15 min a 121^oC.
• Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.

Autoclave os frascos contendo o meio de cultivo F/2

• Para 22 frascos: 22 x 200 ml = 4.4 litros (arredondado para 5 litros).
• Prepare a solução em um frasco de 5 litros e divida em frascos Schott de 1 litro.
• Autoclave : 15 minutos a 15 min a 121^oC.

Após o meio de cultivo resfriar, adicione 0,5 mL de solução de vitaminas (previamente filtrada em filtro de seringa: 0.22 um )

• Nota: Não utilize o filtro de seringa de 0.45 um

Identifique cada frasco Erlenmeyer com etiquetas contendo código (rastreável na lista de amostras do projeto) e data de produção* As datas de produção de cada espécime, adição de solução de nutrientes e coletas de biomassa devem ser documentadas na lista de amostras do projeto.

• Garanta que cada etapa seja realizada de forma meticulosa para assegurar um início apropriado para o cultivo e um rastreamento confiável dos processos subsequentes.

Utilizando alças estéreis, proceder à coleta da biomassa de um cultivo previamente preparado

• Quantidade: "tufo" com dimensões semelhantes a uma moeda de 50 centavos.
• É imperativo realizar todas as operações utilizando luvas descartáveis e minimizar a exposição ao fluxo de ar.
• Vede adequadamente os frascos Erlenmeyer com os Tampões de algodão preparados anteriormente.

Para manter as cianobactérias em fase logarítmica, é essencial fornecer alimentação frequente por meio da adição da Solução Estoque de Nutrientes , preparada previamente

• Em cada cultivo, é recomendado adicionar 200 μL da Solução Estoque de Nutrientes .

A necessidade de nutrientes nas cianobactérias pode ser visualizada pela sua coloração verde característica.

O período de cultivo está estipulado em:

• 28 dias.
• Com a adição da Solução Estoque de Nutrientes a cada intervalo de 7 dias.

Ao término dos 28 dias, de cada frasco Erlenmeyer, será coletada uma quantidade que corresponda visualmente a 80-90% da biomassa

• Permitiremos que cada espécime continue seu crescimento até que seja necessário interrompê-lo.
• Inicialmente, podemos fixar um limite de 4 meses para cada espécime.

Transfira o meio de cultivo de cada frasco Erlenmeyer com a biomassa para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL (tipo Falcon), devidamente identificado com etiqueta (correspondente ao código de referência na lista de amostras)

• Centrifugue : 3011 xg (4500 rpm) por 15 minutos a 4°C
• Descarte o sobrenadante
• Continue transferindo o conteúdo de cada frasco Erlenmeyer, centrifugando e descartando o sobrenadante até completa eliminação de todo o conteúdo aquoso
• Registre o volume de biomassa obtido (foto para arquivo)

Submeta cada amostra devidamente identificada a processo de liofilização à secura

• Cada amostra deve ser identificada separadamente em tubos Falcon limpos e semi-rosqueados (para nao haver contaminação cruzada das amostras)
• Inserir detalhes e observações pertinentes no Metadata.
• Sempre armazene em freezer a -20 ^oC